细胞复苏的成功与否与冻存及复苏操作密切相关。上周，我们分享了细胞冻存中常见的错误细节，详细内容见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本文将重点从复苏的角度分析，排查复苏过程中易出现的问题。

复苏步骤回顾

在开始之前，我们先复习一下细胞复苏的步骤：
1. 提前将水浴锅预热至37℃，并使培养基复温，同时设定好离心机的转速；
2. 准备一个15ml的离心管并加入适量的培养基；
3. 取出冻存管，浸入水浴锅中快速摇晃，使细胞在2分钟内充分融化；
4. 将细胞悬液缓慢滴入已预先添加培养基的离心管中，并以1000rpm进行3分钟的离心；
5. 弃去上清液，重悬细胞并接种至培养器皿，最后放入培养箱中。

常见的复苏错误操作

以下是复苏过程中常见的一些错误操作：
1. 如果液氮罐或冰箱与水浴锅距离较远而未采取保冷措施，细胞在运输过程中可能会开始融化（尤其在夏季）。冻存细胞需放在干冰或冰盒中运输至水浴锅。
2. 在运输冻存管时，避免用手碰触细胞部分或将其放置于口袋内，以免局部温度升高而导致细胞开始融化。应捏住管盖或将其置于容器中进行运输。
3. 不要使用手捂热融化细胞。手掌温度通常不足以达到有效的加热效果，可能导致细胞受热不均匀且降温速度过慢，从而引发细胞死亡。
4. 水浴时未严格控制时间，直接静置在水中而不晃动。复苏应遵循“快融”原则，建议在2分钟内完成细胞的充分融化，水浴时间延长则活率降低。最佳方法为捏住管盖，将管身浸入水中快速摇晃，切勿让冻存管在水浴中静置。
5. 水浴结束后若管内还残留较大冰块，可能导致细胞死亡。这是因为冰块中的细胞升温缓慢，且融化的细胞会因冰块而受到低温损伤。若有同学认为2分钟不足以融化细胞，建议将水浴锅的温度调高至39℃（这是经过小编亲测可行的方法），并加快摇晃速度。此外，为减少污染风险，可以将冻存管放在一次性PE手套内再进行水浴。水浴锅中的水量也需适量，否则冻存管放入后局部温度达不到预设值，从而导致融化缓慢。
6. 细胞融化后若未进行离心去除DMSO，有些同学可能会在融化后直接加入10倍培养基稀释，而不离心直接培养。虽然这对好养的贴壁细胞可行，但并非长久之计，也不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞具有一定的毒性，部分细胞对其较为敏感，如HL-60细胞等。如不清楚自身细胞对DMSO的敏感性，进行离心去除上清才是较安全的选择。

上述内容来自于PG电子的多年经验总结，结合冻存篇的相关知识，基本可有效解决所有复苏失败的问题。如果还有未提及的知识点，欢迎同学们在评论区补充！