**SV40转染人成骨细胞HFOB119培养说明书**

一、细胞培养条件

细胞名称：SV40转染人成骨细胞HFOB119
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）
培养体系：DMEM/F12 + 0.3 mg/ml G418 + 10% FBS
传代方法：建议首次以1:2比例传代。
传代情况：每2天更换培养基。
备注：使用无菌离心管收集瓶中的培养基，以进行过渡对比培养。如果对比结果不理想，建议选购我们的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

在细胞培养至良好状态后，灌满完全培养液并密封瓶口是运输细胞的最佳方式。收到细胞后，使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，放置于超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入33℃、5% CO2培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后进行后续操作。使用显微镜观察细胞生长情况，并在不同倍数下拍照保存（建议40x、100x、200x各一张）。前三天的照片是重要售后依据，未提供照片默认为正常状态。（传代后，建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自己配制的完全培养基进行对比研究，换液后请松开瓶盖。）

三、细胞培养步骤

a、细胞传代

如果细胞的汇合度未超过80%，将完全培养液收集至离心管中，留5ml进行培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于33℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞状况，若细胞大部分变圆并纷纷脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清，然后加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入33℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

b、细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞根据显微镜下状况收缩变圆时，加入5ml完全培养基以终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清后，将沉淀的细胞加入1ml的PG电子无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如果后期需要将细胞转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再进行。

c、细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护设备），快速放入33℃水浴中解冻，直至冻存管内无冰晶状况后，用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入33℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天，换用新鲜的完全培养基进行后续培养。

四、注意事项

某些细胞在贴壁过程中可能不够牢固，运输过程中容易发生脱落，这是正常现象。如脱落数量较多可按照如下方法进行处理：将培养瓶中所有培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养（后期对比培养），沉淀后加入1-2ml胰蛋白酶，轻轻吹打、重悬，消化1-2分钟后，再加5ml完全培养基以终止反应。然后进行离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬，最后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入33℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。

五、售后条款

1. 若细胞出现问题，可重发的情况包括：
• 细胞在运输途中遭遇损坏、丢失等，均可重发。
• 若细胞在收到后48小时内出现污染，需提交真实实验结果以便核实后重发。
• 常温发货细胞在静置24小时后或干冰发货细胞复苏24小时后若发现绝大多数细胞未存活（需提供清晰的细胞状态照片），可重发。
• 若干冰发货细胞复苏后24小时内或常温发货细胞静置4小时并未开封发生污染，可重发。
• 若细胞活性出现问题，请在收到产品7天内提交真实实验结果，采用台盼蓝染色法检测细胞活力，核实后可重发。
• 收到细胞当日及第2、3天内务必拍照，未及时告知的视为产品合格。
• 4-7天内出现问题，需提供前三天的照片及相关操作步骤，技术人员若判定为我方责任则可重发。
2. 不予以重发的情况包括：
• 因客户操作导致的细胞污染。
• 客户操作不当导致的细胞状态不良。
• 非本实验室推荐的培养体系引起的细胞状态不良。
• 细胞状态不良且未提供前三天照片的情况。
• 细胞培养时有其他处理的不予以重发。
• 收到细胞后2天内未告知的问题。
• 具体情况视情况而定。